蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測的方法
多年來，蔬菜中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況一直較突出，農(nóng)藥中毒事件常有報道。究其原因，一是農(nóng)戶不按規(guī)定的用藥量、次數(shù)、方法或安全間隔期施藥，或施用不允許在蔬菜上使用的劇毒、高毒農(nóng)藥；二是現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)施行的農(nóng)藥殘留測定需要通過有機溶劑提取、凈化和用大型分析儀器進行，無法對廉價的蔬菜進行隨時隨地或快速的檢測而形成的監(jiān)管不到位。加強對農(nóng)戶的宣傳指導(dǎo)和建立適合我國國情的、規(guī)范化的農(nóng)藥殘留快速檢測方法，是解決問題的關(guān)鍵所在。
目前所使用的農(nóng)藥按其化學(xué)結(jié)構(gòu)大致可分為以下幾類：有機氯類，有機磷類，氨基甲酸酯類，擬除蟲菊酯類等。在我國農(nóng)藥中，70%為有機磷農(nóng)藥，而在我國生產(chǎn)使用的有機磷農(nóng)藥中，70％為劇毒、高毒類，而且較多是禁止在蔬菜作物上使用的。
根據(jù)以上情況，制定出有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的快速檢測方法，使其不受時間、地點、場合等條件限制，甚至普通消費者也能夠操作使用，有利于及時發(fā)現(xiàn)問題、采取措施，控制高殘留農(nóng)藥蔬菜的攝入，降低農(nóng)藥中毒發(fā)生率，保障消費者食菜安全。
1 范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了由酶抑制法測定蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的快速檢驗方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于蔬菜中有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速篩選測定。
2 原理
膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
3 試劑
3.1固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測卡）。
3.2pH7.5緩沖溶液：分別取15.0g磷酸氫二鈉[Na2HPO4·12H2O]與1.59g無水磷酸二氫鉀[KH2PO4]，用500mL蒸餾水溶解。
4 儀器
4.1常量天平有條件時配備37℃±2℃恒溫裝置
5 分析步驟
5.1整體測定法
5.1.1選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取5g放入帶蓋瓶中，加入10mL緩沖溶液，震搖50次，靜置2min以上。
5.1.2取一片速測卡，用白色藥片沾取提取液，放置10min以上進行預(yù)反應(yīng)，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.1.3將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)。
5.1.4每批測定應(yīng)設(shè)一個緩沖液的空白對照卡。
5.2表面測定法（粗篩法）
5.2.1擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴緩沖溶液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。
5.2.2取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上。
5.2.3放置10min以上進行預(yù)反應(yīng)，有條件時在37℃恒溫裝置中放置10min。預(yù)反應(yīng)后的藥片表面必須保持濕潤。
5.2.4將速測卡對折，用手捏3min或用恒溫裝置恒溫3min，使紅色藥片與白色藥片疊合反應(yīng)。
5.2.5每批測定應(yīng)設(shè)一個緩沖液的空白對照卡。
6 結(jié)果判定
上面為陽性結(jié)果下面為陰性結(jié)果
結(jié)果以酶被有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥抑制（為陽性）、未抑制（為陰性）表示。與空白對照卡比較，白色藥片不變色或略有淺藍(lán)色均為陽性結(jié)果。白色藥片變?yōu)樘焖{(lán)色或與空白對照卡相同，為陰性結(jié)果。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它分析方法進一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
7 附則
7.1速測卡技術(shù)指標(biāo)
7.1.1靈敏度指標(biāo)：速測卡對部分常見農(nóng)藥的檢出限及我國*見表1。
表1部分常見農(nóng)藥的檢出限（mg/kg）及大殘留*（mg/kg）
農(nóng)藥名稱檢出限殘留*農(nóng)藥名稱檢出限殘留*
甲胺磷1.7不得檢出敵敵畏0.30.2
對硫磷1.7不得檢出敵百蟲0.30.1
水胺硫磷3.1不得檢出樂果1.31.0
馬拉硫磷2.0不得檢出西維因2.52.0
久效磷2.5不得檢出好年冬1.0不得檢出
乙酰甲胺磷3.50.2呋喃丹0.5不得檢出
7.1.2符合率：在檢出的30份以上陽性樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
8 說明
8.1蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提或采用表面測定法。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
8.2當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，藥片加液后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以空白對照卡用（體溫）手指捏3分鐘時可以變藍(lán)，即可往下操作。注意樣品放置的時間應(yīng)與空白對照卡放置的時間一致才有可比性。空白對照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖溶液加的少、預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤，二是溫度太低。
方法二酶抑制率法（分光光度法）
9 原理
在一定條件下，有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)。正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計在412nm處測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。
10 試劑
10.1pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
10.2顯色劑：分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，4°C冰箱中保存。
10.3底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。
10.4乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min的吸光度變化DA0值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期不超過四天。
10.5可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的DA0值應(yīng)控制在0.3以上。
11 儀器
11.1分光光度計或相應(yīng)測定儀及常量天平。
12 分析步驟
12.1樣品處理：選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片，取樣品1g，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL緩沖溶液，振蕩1~2min，倒出提取液，靜置3~5min，待用。
12.2對照溶液測試：先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.lmL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37°C放置15min以上（每批樣品的控制時間應(yīng)一致）。加入0.lmL底物搖勻，此時檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DA0。
12.3樣品溶液測試：先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其它操作與對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值DAt。
13 結(jié)果的表述計算
13.1結(jié)果計算
檢測結(jié)果按公式計算：抑制率(%)=[(DA0-DAt)/DA0]×100
式中：DA0棗對照溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；DAt棗樣品溶液反應(yīng)3min吸光度的變化值；
13.2結(jié)果判定
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。當(dāng)蔬菜樣品提取液對酶的抑制率≥50%時，表示蔬菜中有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，樣品為陽性結(jié)果。陽性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢驗2次以上。對陽性結(jié)果的樣品，可用其它方法進一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
14 附則
14.1酶抑制率法技術(shù)指標(biāo)
14.1.1靈敏度指標(biāo)：酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限見表2酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢出限
農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg農(nóng)藥名稱檢出限mg/kg
敵敵畏0.1氧化樂果0.8
對硫磷1.0甲基異柳磷5.0
辛硫磷0.3滅多威0.1
甲胺磷2.0丁硫克百威0.05
馬拉硫磷4.0敵百蟲0.2
樂果3.0呋南丹0.05
14.1.2符合率：在檢出的抑制率≥50%的30份以上樣品中，經(jīng)氣相色譜法驗證，陽性結(jié)果的符合率應(yīng)在80%以上。
15 說明
15.1蔥、蒜、蘿卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中，含有對酶有影響的植物次生物質(zhì)，容易產(chǎn)生假陽性。處理這類樣品時，可采取整株（體）蔬菜浸提。對一些含葉綠素較高的蔬菜，也可采取整株（體）蔬菜浸提的方法，減少色素的干擾。
15.2當(dāng)溫度條件低于37°C，酶反應(yīng)的速度隨之放慢，加入酶液和顯色劑后放置反應(yīng)的時間應(yīng)相對延長，延長時間的確定，應(yīng)以膽堿酯酶空白對照測試3min的吸光度變化DA0值在0.3以上，即可往下操作。注意樣品放置時間應(yīng)與空白對照溶液放置時間一致才有可比性。膽堿酯酶空白對照溶液3min的吸光度變化DA0值＜0.3的原因：一是酶的活性不夠，二是溫度太低。
15.3當(dāng)吸光度大到無法讀取時，說明測定液渾濁有干擾。
16方法注釋
16.1兩種方法的共同點：以上兩種方法的原理、緩沖（提?。┤芤簆H值、測定中的干擾物質(zhì)和排除方法基本相同。
16.2速測卡法的檢出限：方法文本中的表1，是由衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、廣東省食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所、北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所、香港政府化驗所、廣東省農(nóng)藥檢定所、深圳市衛(wèi)生防疫站、華南農(nóng)大昆蟲毒理研究室七個單位，使用速測卡法，對我國常見使用的一些有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥檢出限的實驗與驗證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計表。從表1可以看出，在使用速測卡法檢出蔬菜樣品為農(nóng)藥陽性時，即可視為有機磷或氨基甲酸酯類的農(nóng)藥已超標(biāo)。在有條件的單位，可用氣相色譜儀或質(zhì)譜儀對陽性試樣進行進一步的實驗來確定是哪種農(nóng)藥、確切含量。
16.3酶抑制率法的選擇：在氣相色譜分析儀還未問世及分布較少時，對有機磷類農(nóng)藥的檢測即采取了酶抑制分光光度法，只是由于當(dāng)時酶的純度不夠高、靈敏度較低、酶試劑保存期短、及方法不能區(qū)分出具體的農(nóng)藥而被氣相色譜法所取代。而今用其作為快速分析則恰到好處。只是現(xiàn)在酶試劑的質(zhì)量還應(yīng)進一步提高，有效保存期應(yīng)設(shè)法延長。由于這兩個現(xiàn)實情況，在實驗前，必需測試酶的活性，達(dá)到要求后才能往下進行。
16.4速測卡法操作簡單、使用方便，常溫下試藥的有效期可達(dá)一年。酶抑制率光度法與速測卡法比較操作要煩瑣些，夏天時，試藥需要冷藏運輸，但以數(shù)字形式讀取數(shù)據(jù)，較為直觀。
